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技术支持

PCR技术之RNA抽提实验步骤
发布时间:2014-06-20   点击次数:1424次

一、RNA抽提实验准备工作

1、实验器具与材料:

(1)移液枪:1ml、200ul、10ul

(2)吸头:1ml、200ul、20ul

(3)吸头台:放置1ml吸头的一个,放置200ul和20ul的吸头一个

(4)EP管1.5ml、100ul

(5)玻璃研磨器

(6)容量瓶:1000ml

(7)盐水瓶:100ml

(8)15ml塑料管一个(配75%乙醇用)

2、实验器具的处理与准备

(1)塑料制品:(包括吸头、EP管等)将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。

(2)玻璃制品:(主要是玻璃研磨器)先泡酸过夜,冲洗干净后,在1‰DEPC水中泡8小时左右,37℃烘干,用蒙锡纸包裹送至干烤3次。

(3)金属制品:(镊子等)先洗干净,再送干烤3次。(不需要泡DEPC水)

3、试剂配制和准备:

(1)DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75%乙醇的DEPC水的配制:100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压。

(2)75%乙醇(要在抽提时现配):用无水乙醇和DEPC水配制(DEPC水:无水乙醇=1:3),然后放于-20℃备用。

(3)异丙醇:放入棕色瓶

(4)氯仿:放入棕色瓶

(5)Trizol:100ml/瓶存放于4℃

二、抽提时注意事项:

    全程佩戴一次性手套和口罩,手套要勤换,避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三、抽提步骤

1、匀浆化作用

   取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内,先加0.2ml的Trizol溶液,研磨组织后,倒入1.5mlEP管中,再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗,后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下,室温静置5分钟。

2、分离阶段

   每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒,使其充分混匀,室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。

3、RNA的沉淀

   将上层水相转入新的1.5mlEP管中(约400-500ul),加入0.5ml异丙醇,混匀后放于-20℃中1小时,后12000rmp离心10分钟。

4、RNA的洗脱

   小心倒掉上清,留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇(预冷)振荡洗涤RNA沉淀一次,后7500rmp离心5分钟。

5、RNA的再溶解

   小心倒掉上清,取沉淀置PCR超净工作台开风机吹干(约30分钟,此时RNA沉淀变透明)。注意不能让RNA沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性)。再在管中加20ul的DEPC水溶解,在55-60℃下孵育10分钟助溶。

6、RNA的保存

   提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中,或立即用于逆转录。

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