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技术支持

两步法与荧光法两种PCR检测方法简介
发布时间:2014-10-15   点击次数:1316次
 一、两步法
 
    是指在用套式PCR方法扩增某些含量低微的标本时,两对引物在同一个管中以简化步骤,减少污染。通常*步进行20-25个循环,扩增外引物片段;第二步再进行10个循环,扩增内引物片段。两步法对内外引物的Tm值有特殊要求,即内外引物的退火温度高(如68℃),在此温度下内引物不与模板退火,然后降低退火温度(至55℃)再扩增内引物片段,这样,在操作过程中,仅打开PCR反应管一次,大大减少了污染的可能性。
 
二、荧光法
 
    亦称荧光PCR技术(fluoresence PCR, F-PCR),是1995年由美国PE公司首先研制成功的,它融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术定量的优点,电脑同步跟踪,数据自动化处理,直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果,不需要做PCR后处理或检测,完全闭管操作。探针标记除用TET和FAM外,还可用HEX、JOE作为报告荧光,3′端的淬灭基团常用TAMRA。在探针保持完整时,荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭,而在探针被切断后,荧光报告基团才发出报告荧光,且荧光的强度与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。
 
    主要有以下优点:
1、探针特异性强,假阳性率低;
2、操作快速,不需要PCR后处理;
3、定量范围宽,HBV 0.4fg-4000fg/ml(102-106 Dane′s particle/ml);
4、闭管操作,PCR产物污染少;
5、灵敏度高。

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